【摘要】 目的 探讨N5,N10亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因多态性与老年冠心病的关系。方法 应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)检测114例冠心病患者及31例对照组MTHFR基因多态性。结果 冠心病组与对照组MTHFR基因C677T位点各基因型频率、T等位基因频率、T/T纯合子频率差异无显著性差异。结论MTHFR基因多态性与老年冠心病无显著关系,不能被确定为老年冠心病的独立危险因素。

【关键词】

MTHFR基因多态性;冠心病

The relationship between coronary heart disease and methylenetetrahy drofolate reductase in elderlyLI Xiao-bo,LI Yan,LI Ya-ping,et al.Department of Senior Cadres,The First People’s Hospital of Yunnan Province,Kunming 650032,Chia

【Abstract】 Objective To observe the relationship of polymorphisms in methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR)and coronary heart disease(CHD)in the elderly.Methods Polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism(PCR-RFLP)was used to analyze the MTHFR C677T genotypes in a sample of 114 cases with documented CHD and 31 controls among the elderly patients.Results There were no differences in genotype frequency or allele frequencies between CHD and the control.Conclusion MTHFR gene mutation cannot ascertained to be independent risk of coronary heart disease in the elderly.

【Key words】

Methylenetetrahydrofolate reductase;Polymorphism;Coronary heart disease

冠状动脉粥样硬化性心脏病简称冠心病(coronary heart disease CHD),是指由于冠状动脉粥样硬化使管腔狭窄或阻塞导致心肌缺血缺氧而引起的心脏病,是临床上最为常见的心血管疾病,发病率和病死率都较高,严重影响人类生活质量。N5,N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(methylenetetrahydrofolate reductase,MTHFR)是一种黄素蛋白,催化体内N5,N10-亚甲基四氢叶酸生成N5-亚甲基四氢叶酸的还原反应,其活性降低可引起同型半胱氨酸血症^[1]。轻-中度高同型半胱氨酸血症是动脉粥样硬化和脑梗死重要的独立危险因素^[2]。1995年Frosst等^[3]报告,MTHFR基因C677T突变,致不耐热性增加而活性大大减低,从而抑制蛋氨酸循环中Hcy再甲基化过程,导致Hcy水平升高。MTHFR基因作为冠心病的一个候选基因,成为近年来的研究热点。本研究通过对114例冠心病患者及31例对照组MTHFR基因多态性进行测定,探讨老年冠心病患者与MTHFR基因多态性的关系。

1 对象和方法

1.1 研究对象 所有研究对象均为2005年7月至2007年2月间收入我科的老年住院患者,分为冠心病组和对照组,均经临床症状、心肌酶学、心电图及冠状动脉造影确诊,两组年龄相当。冠心病组114例,对照组31例。两组均排除肝肾功能不全、恶性肿瘤及周围血管疾病等。

1.2 方法

1.2.1 实验方法

1.2.1.1 模板DNA的制备 抗凝血经提纯外周血有核细胞后,用基因组DNA抽提试剂盒(上海生工)提取基因组DNA后,置于4℃保存待用。

1.2.1.2引物设计 上游引物:5’-CCC CAA AGG CCA CCC CGA AGC AG-3’,下游引物:5’-CCG GGG ACG ATG GGG CAA GTG A-3’。扩增MTHFR基因中含多态性位点的DNA片段,扩增产物长度174 bp。

1.2.1.3 PCR反应条件 95℃预变性5 min,然后按96℃ 30 s,65℃ 30 s,72℃ 30 s,循环35次,末次循环后72℃延伸5 min,产物经含EB的2%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.1.4 MTHFR基因限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism,RFLP)分析取10 μl扩增产物,加入8个单位HinfI内切酶及其缓冲液,37℃消化3~5 h。取上述酶切产物,进行2%的琼脂糖凝胶电泳并判读MTHFR基因分型结果。

1.2.2 统计学方法 采用SPSS软件包,建立数据库,冠心病组与对照组组间均衡比较用χ²检验及两样本t检验。等位基因频率用基因计数法,等位基因频率及基因频率符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律,各基因频率均达平衡,具有群体代表性。两组间等位基因频率、基因型频率比较用χ²检验。组间血脂水平计量数据处理用两样本t检验。

2 结果

本研究中,冠心病组114例,平均年龄(77.38±5.68)岁,其中男88例,女26例;对照组31例,平均年龄(75.88±4.26)岁,其中男27例,女4例。χ²检验表明,两组间性别无明显差异。两样本t检验表明,两组间年龄无明显差异。

2.1 MTHFR基因PCR扩增结果及限制性片段长度多态性分析 扩增产物长度174 bp,经限制性HinfI内切酶切后,得到三种基因型:C/C无突变野生型,仅见一条174 bp的电泳带;T/T 突变纯合子,可见2条电泳带,分别为102 bp及72 bp;C/T突变杂合子,可见3条电泳带,分别为174 bp、102 bp和72 bp(见图1)。

2.2 冠心病组和对照组MTHFR基因多态性分布比较 冠心病组和对照组间基因型频率比较无显著性差异(χ²=0.276,P=0.871);两组间等位基因频率比较也无显著性差异(χ²=0.123,P=0.726)。

3 讨论

同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)是一种含硫基的氨基酸,是蛋氨酸代谢循环的重要中间产物。1969年McCully^[4]首次报道,高同型半胱氨酸血症可能是动脉粥样硬化的危险因素之一。目前国内外研究证实高同型半胱氨酸血症是心脑血管疾病重要的独立危险因素。MTHFR是同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)再甲基化途径中的关键酶,1994年Goyette等^[5]用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分离出人类MTHFR的cDNA。人类MTHFR基因定位于常染色体1P36,3上,全长2.2Kb,包括11个外显子^[6]。其编码产物是1个相对分子质量为77000的具有催化活性的蛋白质。MTHFR基因不同的突变类型对MTHFR的酶活性和热稳定性产生不同的影响。目前已发现导致该酶缺陷的突变有二十多种。Frosst等^[3]证实MTHFR基因在677位点上的突变最常见,碱基C被T取代使编码的丙氨酸被缬氨酸替代,造成MTHFR活性下降。由于C677T位于MTHFR催化区域,其突变直接导致MTHFR的活性和耐热性降低,导致同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)的再甲基化过程出现障碍,引起Hcy水平升高。根据C突变为T后产生的HinfI限制性内切酶酶切位点,可将其分成3种基因型,CC型(野生型)最多见,其次是CT型(杂合子型),TT型(突变的纯合子型)最少。Frosst等认为TT基因型导致外周血Hcy水平的升高,并且MTHFR基因677C→T多态性与中度高Hcy的这种联系主要在叶酸水平较低时才存在。但是目前国内外对MTHFR基因多态性与冠心病的关系尚存在较大的争议。

图1 三种MTHFR基因型PCR-RFLP法2%琼脂糖凝胶电泳图谱

从左至右依次为:50 bp Ladder DNA Marker;基因型依次为:C/T,T/T,C/C;PCR产物;DL2000 DNA Marker

在本次研究中,我们应用PCR-RFLP技术对114例老年冠心病和31例对照组进行MTHFRC677T多态性的检测。结果发现,冠心病组和对照组间等位基因频率、基因型频率的分布没有显著性差异。所以,我们认为,在本组病例中,MTHFRC677T多态性可能不是老年人冠心病的独立危险因素。Zheng等^[7]及Rothenbacher等^[8]研究表明,MTHFR基因多态性与冠心病无显著相关。但日本Morita等^[9]报道362例男性冠心病患者中MTHFR基因TT纯合突变明显高于正常组。欧洲9个国家一个协作项目研究表明,特别是当血浆HCY升高和叶酸降低时,MTHFR基因C 677T突变T纯合基因型是心血管疾病的风险因子^[10]。造成不同研究结果的原因可能是MTHFR基因C677T具有种族和民族的差异,从而不同种族、不同民族对疾病的易感性不同^[10]。因此,MTHFR基因多态性与冠心病的关系仍需进一步研究。

参 考 文 献

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