【摘要】目的 研究Ad-HGF转染脐血干细胞对大鼠坐骨神经损伤后神经电生理的影响。方法 5只Wistar大鼠构建坐骨神经损伤模型，构建成功后大鼠随机分为三组，Ad-HGF基因修饰脐血干细胞组（A组），脐血干细胞组（B组），磷酸盐缓冲液组（C组），每组15只。术后4、6、8周每组各取5只大鼠，腹腔麻醉后，暴露双侧坐骨神经，记录神经电生理的变化。结果 不同观察时间点内，A组运动神经传导速度、复合肌肉动作电位波幅及潜伏期检测指标明显优于B组和C组（P<0.05），A组神经功能的恢复明显优于B组和C组（P<0.05）。结论 d-HGF修饰的脐血干细胞对坐骨神经损伤后的再生修复具有很大的优势，为临床上周围神经损伤提供新的治疗方法和理论依据。

【关键词】Ad-HGF转染的脐血干细胞，坐骨神经损伤，神经电生理

【中图分类号】R722.12 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2014）05-0038-01

脐血干细胞来源广泛、取材方便，具备多项分化潜能备受关注，而且脐血免疫源性较弱，即便HLA抗原不相容者亦能部分耐受移植，临床已应用脐血干细胞移植治疗免疫缺陷病人及用于造血系统重建。许多学者相继报道脐血干细胞经定向诱导可分化为神经元及胶质细胞样细胞，更有研究表明未经任何处理的脐带血单个核细胞已经表达神经元特异性标记物nestin，NF-M及MAP2 mRNA[1]。肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor， HGF）是一种具有多种生物学活性的细胞因子，广泛分布于全身组织器官，系多效性因子。新近研究表明，HGF是一种新的神经营养因子，对中枢神经系统有保护作用[2]，对神经系统的生长发育有促进作用，对运动神经元的发育、存活、轴突的生长和导向、肌肉营养均具重要作用[3]。在临床上，由于外伤和肿瘤等原因造成的周围神经缺损十分常见，而且修复效果差，致残率高。本文通过组织工程学原理，将脐血干细胞与肝细胞生长因子结合治疗坐骨神经损伤并对其进行神经电生理检测，以探讨其对实验性坐骨神经损伤后的再生与修复作用。

1 材料与动物

1.1 实验动物 3月龄Wistar雌性大鼠，体重（180±40）g，由甘肃省中医学院提供，动物合格证号：SCXK（甘）2004-0006。

1.2 实验材料 DMEM培养基（美国SIGMA公司），小牛血清（美国GIBCO公司），胰蛋白酶（美国SIGMA公司）。

2实验方法

2.1脐带血干细胞体外培养 用脐静脉穿刺法抽取健康足月产妇约50ml脐血，采用密度梯度离心法分离，用含10%血清的DMEM-LG分瓶培养，本实验使用细胞为传代培养的3-5代细胞。

2.2 Ad-HGF修饰脐带血干细胞 将生长旺盛的脐血干细胞以1×106个/孔接种于6孔板，24h后弃去培养上清，加入含Ad-HGF病毒颗粒的DMEM-LG培养基（MOI=100pfu/cell）孵育2h，换含5%血清的培养基继续培养48h。

2.3 实验模型建立及分组 45只成年Wistar大鼠，体质量（180±40）g，随机分为Ad-HGF基因修饰脐血干细胞组（A组），脐血干细胞组（B组），磷酸盐缓冲液组（C组），每组15只。模型制备参照Valero等[4]的方法，用1.5g/L戊巴比妥钠按50mg/kg作腹腔麻醉，无菌条件下显露右坐骨神经，在坐骨结节下方5mm处，用特制的无齿蚊式钳钳夹坐骨神经15s，造成3mm长度挫伤。将制备好的Ad-HGF修饰的脐血干细胞悬液（1×106个细胞） 2μl，脐血干细胞悬液（1×106个细胞）2μl，磷酸盐缓冲液2μl用注射器植入到损伤处。用丝线缝合在捻挫点处肌肉上做标志，缝合分离的肌肉和皮肤。逐层缝合肌肉、皮肤。

2.4 神经电生理检测 术后4、6、8周每组各取5只大鼠，腹腔麻醉后，暴露双侧坐骨神经，采用MSS02型生物信号记录系统，将接收电极置于腓肠肌肌腹中，刺激电极分别置于吻合口远近端各5mm处进行刺激，分别记录双侧复合肌肉动作电位波幅（CMAP），潜伏期（Lat），计算出传导时间及运动神经传导速度（MCV），并与各自健侧比较得出恢复率（%）。

2.5 统计学分析 采用SPSS10.0统计软件处理，数据间差异用单因素方差分析，两组间均数比较用Student-Newman-Keuls法，以P<0.05作为检验标准。

3 结果

3.1 脐血干细胞的分离培养与扩增 原代细胞经过24h体外培养后有少量细胞贴壁细胞，在4天内呈相对静止状态，之后细胞生长速度加快，并呈克隆样生长，12天左右达到细胞融合，细胞形态成比较均一的梭形。

3.2 术后不同观察时间点内，A组运动神经传导速度、复合肌肉动作电位波幅及潜伏期检测指标明显优于B组和C组（P<0.05），B组居中，C组最差（P<0.05）。见表1。

表1各组在不同时间点运动神经传导速度、复合肌肉动作电位波幅及潜伏期的比较（ X±s）

3.3 术后不同观察时间点内，A组神经功能的恢复明显优于B组和C组（P<0.05），B组居中，C组最差（P<0.01）。见表2。

4 讨论

周围神经损伤后，神经元胞体肿胀，尼氏体消失，细胞核偏移，突触终端减少，远端轴突和髓鞘因瓦氏变性而崩解，损伤修复后，能否成功再生主要取决于是否具有适合其生长的微环境条件。许多学者相继报道脐血干细胞经定向诱导可分化为神经元及胶质细胞样细胞[5]，由于脐血干细胞的神经分化潜能，利用脐血干细胞脑内移植治疗神经系统疾病成为可能。鉴于此，本实验中将Ad-HGF转染脐血干细胞应用于坐骨神经损伤，具有理论上的可行性。

神经电生理的变化是评价神经损伤及修复最早、最敏感的客观指标，神经传导速度、潜伏期及波幅的测定有助于确定临床上坐骨神经病变的性质、程度和范围。实验中得出随着时间的推移在第4周、6周、8周后患侧坐骨神经CMAP和MCV随观察时间的延长，其恢复逐渐增加，而Lat则逐渐降低，尤其是Ad-HGF转染脐血干细胞治疗组效果明显。这表明损伤的坐骨神经在Ad-HGF转染脐血干细胞的促进再生与修复作用下，时限明显缩短，功能明显恢复。同时间点神经恢复率的比较也证实Ad-HGF转染脐血干细胞再治疗坐骨神经损伤的优势，但8周后各组恢复率仍与健侧有别，这表明神经修复与再生不完全，可能需要更多的时间。Ad-HGF转染脐血干细胞在促进神经的再生与功能恢复推断机理可能有下几个方面：（1）.二者的结合，HGF减少了受体细胞脐血干细胞的凋亡，增加了细胞因子的时限性；（2）移植的一部分脐血干细胞可能分化为神经胶质细胞支持、保护轴突，形成髓鞘，另外还可转化为神经元，轴突直接长入所支配的肌肉，促进肢体功能的恢复；（3）作为神经营养因子的肝细胞生长因子是再生微环境中的重要因素，对再生神经的生长和走向起重要的营养和诱导作用，在局部应用外源性神经营养因子将会使周围神经再生的微环境更加完善，这对促进周围神经再生，提高神经功能恢复率将有重要意义。

综上所述，Ad-HGF修饰的脐血干细胞对坐骨神经损伤后的再生修复具有很大的优势，为临床上周围神经损伤提供新的治疗方法和理论依据。

参考文献

[1]鄂义海，曹孟德，刘计荣，等.脐血细胞培养前后的形态改变及神经细胞特有分子表达[J].中华神经外科杂志，2004，20（5）：413-416.

[2] Jeong JA， Gang EJ， Hong SH，et al. Rapid neural differentiation of human cordblood-derived mesenchymal stem cells[J]. Neuroreport ，2004， 15（11）：1731-1734.

[3]Tsuboi Y， Kakimoto K， Akatsu H，et al.Hepatocyte growth factor in cerebr ospinal fluid in neurologicdisease[J].Acta Neurol Scand， 2002， 106：99-103.

[4]Valero-Cabré A， Navarro X. H reflex restitution and facilitation after different types of peripheral nerve injury and repair [J]. Brain Res，2001，919（2）：302-312.

[5]Koyama J， Yokouchi K， et al. Neurotrophic effect of hepatocyte growth factor on neonatal facial motor neurons [J]. Neurol Res， 2003， 25：701-707.