材料与方法

1.1  样品

以神农架地区晒青毛茶（嫩度为带红梗修剪新梢）为原料，设置渥堆轻发酵和适度发酵两个处理。渥堆试验在人工气候箱（RXZ-328A型）进行，渥堆叶含水量38%、温度45 ℃、湿度85%，渥堆时间轻发酵为9 d，适度发酵为15 d。渥堆结束后在SKFG-01型电热恒温鼓风干燥箱中烘干，得到轻发酵和适度发酵青砖茶原料。

1.2  试验动物

健康成年昆明种小鼠，体重（25±1） g，SPF级，由湖北省实验动物研究中心提供，许可证号：SCXK（鄂）2015-0018。

1.3  药品及试剂

营养性半固体型糊的制备：10 g羧甲基纤维素钠加奶粉16 g、蔗糖8 g、淀粉8 g、活性炭5 g溶于250 mL去离子水中搅拌均匀制成300 mL（约300 g）半固体糊状物，冰箱冷藏，用前2 h取出，恢复至室温。肠道菌群培养基及生产厂家如表1所示。

1.4  主要设备

AW220型电子分析天平、RXZ-328A型人工气候箱、SKFG-01型鼓风干燥箱、巨轮牌FZ102型植物粉碎机、SW-CJ-2FD型超净工作台、HH-6型数显恒温水浴锅、DNP系列电热恒温培养箱、厌氧盒、高压灭菌锅、常规玻璃仪器等。

1.5  试验方法

1.5.1  不同渥堆程度青砖茶水提物的主要化学成分测定  茶多酚总量采用福林酚法[10]，儿茶素组分、咖啡碱、有机酸含量采用高效液相色谱法（HPLC），氨基酸总量检测采用茚三酮显色法[11]，水浸出物含量采用重量法[12]，可溶性糖含量采用蒽酮比色法[13]，茶黄素、茶红素和茶褐素含量采用系统法[14，15]。所有试验重复3次。

儿茶素组分及咖啡碱含量检测的HPLC条件：用70%甲醇在70 ℃水浴中浸提样品10 min，3 000 r/min离心10 min过0.45 μm滤膜后待测。HPLC条件：LC1200，Agilent，USA;色谱柱，Agilent TC-C18（4.6 μm×250 mm）;进样量5 μL;流速1 mL/min;温度35 ℃;检测波长280 nm;流动相A，去离子水（0.1%甲酸）;流动相B，甲醇（0.1%甲酸）;梯度洗脱条件，0～10 min，100% A;10～20 min，68%A和32%B;20～30 min，100% A。

有机酸组分含量检测的HPLC条件：用去离子水在100 ℃水浴中浸提20 min，脱脂棉过滤，用微孔滤膜过滤。色谱柱：Agilent HB-C18，色谱条件：柱温：30 ℃;流速：0.4 mL/min;进样量10 μL;检测波长：210 nm;流动相A：KH2PO4，流动相B：甲醇;梯度洗脱条件，0～5 min，99%A，1%B;5～25 min，97%A，3%B;25～30 min，99%A，1%B。

1.5.2  青砖茶水提物的制备  称取青砖茶茶粉，以茶水比1∶15微沸提取30 min，抽滤，旋转蒸发浓缩，控制浓缩体积，配制成不同渥堆程度青砖茶茶汤。

1.5.3  青砖茶水提物剂量的选择  参考黑茶吸收试验人体推荐量为每人10 g（成人60 kg）每日，试验设计剂量为人体推荐量的10倍（1 667 mg/kg）[6]，另设正常对照组加入等体积去离子水。

1.5.4  不同渥堆程度青砖茶对正常小鼠胃排空和小肠推进功能的影响  小鼠适应饲养4 d后，开始正式试验。取健康小鼠40只，全为雄性，随机分为正常对照组、适度发酵组、轻发酵组、晒青毛茶组，每组10只。每组按每只0.15 mL/10 g分别灌胃，1次/d，连续给青砖茶水提物15 d;正常對照组灌胃等体积的去离子水。末次灌胃前24 h，小鼠禁食不禁水。第15 天给予青砖茶水提物后30 min，每只小鼠灌胃5%的炭末混悬液（用1%的羧甲基纤维素钠配制）0.8 mL。灌营养性半固体糊25 min后，小鼠脱颈椎处死，取胃，滤纸拭干后称全重，沿胃大弯剪开胃体，洗去胃内容物后拭干称胃净重。胃全重和胃净重的差值为胃残留物重，以此与所灌半固体糊的重量百分比为胃内残留率（%）。迅速取出小鼠的胃及回盲肠部位的整段小肠，剪取上端自幽门、下端至回盲部的肠管，轻轻剥离后不加牵引直铺于白纸上，铺直后测量幽门至炭末前沿的距离，以幽门至炭末前沿的距离占幽门至回盲部全长的百分比为炭末推进百分率（%）。胃内容物残留率=（胃全重-胃净重）/半固体糊重×100%;炭末推进率=（炭末移动距离/肠总长度）×100%。

1.5.5  不同渥堆程度青砖茶对正常小鼠肠道菌群的影响  无菌采集小鼠新鲜粪便0.1～0.4 g，置于己称重的干燥灭菌小试管中，充分震荡，直至粪便分散均匀，再依次10 倍稀释至10-9，4 h内完成。根据预试验结果，选择合适的稀释度，分别取1 mL接种到各类选择性培养基上并各做3个重复，EMB培养基和胆汁七叶苷叠氮钠琼脂培养基放入37 ℃需氧培养24～48 h后计数，BBL培养基及MRS培养基37 ℃厌氧培养24～48 h 后计数。根据菌落形态，涂片分析计算各菌群每克粪便中菌落形成数，结果以对数表示（lgCFU/g）。

1.6  数据处理

试验数据用Excel 2010和SPSS 18.0软件统计处理分析。SPSS 18.0试验数据用（x±s）表示，采用单因素方差分析，组间用两两比较差异法。

2  结果与分析

2.1  不同渥堆程度青砖茶主要品质成分测定结果

随着发酵时间的进行，在微生物和湿热共同作用下，晒青毛茶逐渐渥堆发酵为轻度发酵青砖和适度发酵青砖。由表2可知，游离氨基酸、茶多酚、可溶性糖、水浸出物、茶黄素、茶红素含量均随着渥堆时间的延长呈急剧下降趋势，茶褐素含量呈上升趋势。其中，与晒青毛茶相比，轻发酵青砖游离氨基酸、茶多酚、可溶性糖、水浸出物、茶黄素、茶红素含量分别下降了53.30%、35.10%、45.90%、17.22%、37.50%、55.90%，茶褐素含量上升了59.29%;适度发酵青砖游离氨基酸、茶多酚、可溶性糖、水浸出物、茶黄素、茶红素含量分别下降了71.81%、82.51%、54.77%、39.71%、62.50%、91.28%，茶褐素含量上升了103.57%。且在每一种内含成分含量中，不同发酵组间均有极显著性差异（P<0.01）。其中，晒青毛茶茶多酚含量较一般绿茶含量低很多，这与本试验采用原料为带红梗新梢，比较粗老，而且存放一年有关。

由表3可知，不同渥堆时间对儿茶素和咖啡碱含量有显著影响。渥堆至15 d时，在适度发酵青砖茶中GC、ECG、EC未能检出。随着发酵时间的增加，青砖茶EGC、C、EGCG含量极显著降低（P<0.01），与晒青毛茶相比，发酵9 d分别极显著降低35.53%、28.89%、93.53%，发酵15 d分别极显著降低95.49%、91.85%、99.60%。尽管晒青毛茶在发酵9 d后GC含量略微增加，但发酵15 d后含量降低至未检出，说明GC在发酵后期消耗大于产生。与之相反的是，CG含量在发酵9 d后极显著增加，但随着发酵时间的增加无显著变化，可能发酵9 d GC含量已达峰值。咖啡碱含量随发酵程度的深入而呈现上升趋势，这与茶叶渥堆有关。渥堆过程由于湿热作用以及微生物作用，伴随着物质的分解与散失，渥堆结束后损失率一般在20%～35%，总重量减少，而咖啡碱是相对比较稳定的物质，因而含量升高[16]。

由表4可知，在不同渥堆程度青砖茶有机酸组分中，α-酮戊二酸、乙酸含量均未检出，晒青毛茶中奎宁酸未检出，适度发酵青砖茶中富马酸未检出。苹果酸、乳酸含量随发酵时间的增加而极显著减少（P<0.01），而草酸、奎宁酸、琥珀酸随发酵时间增加而极显著增加。此外，与晒青毛茶相比，发酵9 d与15 d青砖茶的柠檬酸含量、没食子酸含量显著增加（显著性分别为P<0.01、P<0.05），但轻发酵青砖茶的柠檬酸含量极显著高于适度发酵青砖茶。轻发酵青砖茶和适度发酵青砖茶有机酸总量较晒青毛茶分别提高了1.10、1.32倍，与之前研究结果较为一致[17，18]。

2.2  不同渥堆程度青砖茶水提物对小鼠胃排空的影响

由表5可见，连续15 d 给予小鼠不同渥堆程度青砖茶水提物后，与空白对照组相比，适度发酵青砖茶小鼠胃内容残留率显著下降了28.77%，晒青毛茶组与轻发酵青砖茶对小鼠胃排空功能无显著影响，即P>0.05。然而从不同渥堆程度角度分析结果表明，与晒青毛茶组相比，轻度发酵青砖茶能显著降低胃残留率（P<0.05），适度发酵青砖茶能极显著降低胃残留率（P<0.01），说明发酵时间的增长利于小鼠胃排空作用，原因可能是随着晒青毛茶发酵时间的延长，内含物质之间相互转化，改善小鼠胃pH，增强了小鼠胃的消化吸收功能。

2.3  不同渥堆程度青砖茶水提物对小鼠小肠推进的影响

由表6可见，在给小鼠连续灌胃不同渥堆程度青砖茶水提物15 d以后，小鼠的小肠推进能力发生了明显变化。与空白对照组相比较，晒青毛茶组小鼠的小肠推进率略微减少了7.62%（P>0.05），轻发酵组和适度发酵组青砖茶小鼠的小肠推进率分别显著提高了18.83%、26.49%。从不同渥堆程度青砖茶组差异来看，晒青毛茶组与轻度发酵组、适度发酵青砖茶组均达到极显著性差异，即P<0.01。结果表明，轻度发酵茶组、适度发酵青砖茶均能改善小鼠小肠推进能力，而晒青毛茶作用不明显，说明晒青毛茶随着发酵时间的增加，对小鼠小肠推动作用越来越明显，以适度发酵（15 d）较优。

2.4  不同渥堆程度青砖茶水提物对小鼠肠道菌群的影响

不同渥堆程度青砖茶对小鼠连续灌胃15 d后，无菌采集小鼠粪便检测肠道各菌群变化情况如表7。与空白对照组相比，轻发酵青砖茶和适度发酵青砖茶均能显著促进有益菌双歧杆菌、乳杆菌的生长，抑制有害菌肠球菌、肠杆菌的增殖，但轻发酵组与适度发酵组无显著性差异。晒青毛茶对小鼠肠道菌群的变化无显著影响。说明晒青毛茶经过发酵后，内含物质的转变有利于改善肠道微生物环境。

2.5  不同渥堆程度青砖茶主要理化成分与小鼠胃肠道功能相关性分析

人体蛋白的分解多在胃和小肠中进行，小肠和胃中的蛋白酶可由胰蛋白酶激活酶原而释放出有活性的蛋白酶， 因此在摄入含有较高浓的紧压茶汁后， 通过提高胰蛋白酶活性，同时激活小肠和胃的蛋白酶，加快食物的分解和吸收。丁玲[19]研究了茯砖茶加工过程中主要化学成分与胰酶激活反应值相关性分析发现，具有显著性相关的因素为两组，一组为多酚类物质，另一组为有机酸类。陈文峰等[20]研究了紧压茶中茶多酚、有机酸与蛋白酶活力的相关性发现，茶多酚含量与蛋白酶活力相关系数为0.937 3，酸性物质含量与蛋白酶活力相关系数为0.489。对不同渥堆程度青砖茶理化成分与小鼠胃肠道功能各指标进行相关性分析，由表8可知，小鼠胃殘留率、肠杆菌、肠球菌与不同发酵青砖茶中茶褐素、草酸、奎宁酸、琥珀酸、柠檬酸、没食子酸、有机酸总量极显著负相关，与游离氨基酸、茶多酚、可溶性糖、水浸出物、茶黄素、茶红素、EGC、EGCG、儿茶素总量、苹果酸极显著正相关。而小肠推进率、乳杆菌、双歧杆菌与茶褐素、草酸、奎宁酸、琥珀酸、柠檬酸、没食子酸、有机酸总量极显著正相关，与游离氨基酸、茶多酚、可溶性糖、水浸出物、茶黄素、茶红素、EGC、EGCG、苹果酸极显著负相关。

3  讨论

青砖茶属于后发酵的黑茶类，是以成熟新梢为原料，先加工成晒青毛茶，然后经过渥堆发酵、干燥、再拼配、蒸压成型、低温长烘、陈化等工序，形成青砖茶独特的品质特征，渥堆发酵是青砖茶品质形成的关键工序。在这个过程中，晒青毛茶同时受到湿热、微生物和酶的作用，内含成分较晒青毛茶发生了显著变化[20-22]。从本试验结果来看，主要表现在游离氨基酸、茶多酚、可溶性糖、水浸出物、茶黄素、茶红素、EGC、EC、EGC、C、EGCG、酒石酸、苹果酸、乳酸含量随着渥堆时间的延长显著下降，茶褐素、咖啡碱、草酸、奎宁酸、琥珀酸、没食子酸含量显著上升。因此，不同渥堆程度青砖茶对小鼠胃肠道功能的影响有较大差异。轻发酵青砖茶、适度发酵青砖茶对小鼠胃排空、小肠推进作用明显，能显著促进有益菌双歧杆菌、乳杆菌的生长繁殖，抑制有害菌肠球菌、肠杆菌的生长繁殖，提示青砖茶具有改善小鼠胃肠道功能。同时，适度发酵青砖茶效果优于轻发酵青砖茶，而晒青毛茶未起积极作用。

青砖茶改善小鼠胃肠道功能的活性物质可能是某几种物质互作效果。岳随娟等[23]通过灌胃茶褐素后发现，茶褐素能促进大鼠肠道乳酸杆菌、双歧杆菌增殖，抑制大肠杆菌、肠球菌生长的作用。李俊良等[24]研究了柠檬酸对肉仔鸡生长性能、肠道菌群等相关指标的影响发现，柠檬酸处理组肠道乳酸菌含量有升高趋势，大肠杆菌含量有降低趋势，并能改善小肠黏膜绒毛形态结构。翁蔚等[25]研究了不同发酵时间绿茶汁产物（乙醇、有机酸和茶多酚）的抑菌作用发现，绿茶汁发酵产物对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌两种有害菌也有着明显的抑制效果，对乳酸杆菌有一定促生的作用，而发酵时间的延长会进一步增强促生作用。虞希冲等[26]人发现茶氨酸能抑制摄食和胃排空作用，可能与抑制下丘脑外侧核的NMDA受体和AMPA受体有关。史先振等[27]、朱建鹏[28]分别发现木糖、健胃消食片原材料浸膏中多糖组分对胃肠道功能有一定的作用。于玲等[29]对含有较多多酚类物质的葡萄酒酿造工艺研究中發现微生物发酵多酚类物质可产生较多的有机酸，并且那淑敏等[30]发现茶多酚和有机酸两者都能对肠胃道消化功能起促进作用。上述文献说明了茶多酚和有机酸能抑制致病菌的生长，促进有益菌的增殖，而在本试验中发现茶多酚含量较高（8.29%）的晒青毛茶改善小鼠肠道微生物环境并不明显，且在试验中发现有个别小鼠胃胀气现象，有可能是因为茶多酚含量过高，小鼠肠胃受到刺激，胃黏膜损伤。因此结合不同渥堆程度青砖茶理化成分与胃肠道指标相关性分析可知，不同发酵青砖茶中茶褐素、咖啡碱、草酸、奎宁酸、琥珀酸、柠檬酸、没食子酸与小鼠胃残留率、肠杆菌、肠球菌极显著负相关，与小鼠推进率、乳杆菌、双歧杆菌极显著正相关。由此推断，不同渥堆程度青砖茶改善小鼠胃肠道功能的物质为茶褐素、柠檬酸、奎宁酸、琥珀酸、没食子酸等，且可以推断这几种化合物具有一定的互作效果。

参考文献：

[1] 范竹萍，盛  黎，黄  欢，等.胃肠道疾病治疗药物开发[J].世界临床药物，2006，27（12）：729-734.

[2] 张照楠，陈瑞雪，王跃飞，等.药物与肠道菌群的相互作用[J].中药材，2015，38（6）：1319-1323.

[3] 狄英杰.近代湖北羊楼洞茶业经济与文化研究[D].武汉：华中农业大学，2011.

[4] 许靖逸，崔修丹，陈昌辉，等.六大茶类对部分肠道致病菌抑菌效果的研究[J].食品工业科技，2013（16）：140-142.

[5] 李世刚，郑倩倩，何建刚，等.湖北青砖茶对IBS-D模型大鼠肠道敏感性的影响[J].茶叶科学，2016，36（3）：245-249.

[6] 吴香兰.黑茶改善小鼠胃肠道功能的实验研究[D].长沙：湖南农业大学，2013.

[7] KAZUKO S，YOSHIO K，MITSUTOSHI Y，et al. Effect of Dai-kenchu-to（Da-Jian-Zhong-Tang） on the delayed intestinal propulsion induced by chlorpromazine in mice[J].Journal of ethnopharmacology，2003，86（1）：37-44.

[8] 惠  琅，李  聪，白  斌，等.腌制沙芥提取物促胃肠动力活性研究[J].西北大学学报（自然科学版），2010，40（6）：995-998.

[9] 顾喜明，郭  吕.我国中医药胃肠动力基础实验方法研究进展[J].辽宁中医药大学学报，2007，9（2）：60-61.

[10] 胡绍德，陈畅畅，李大祥，等.黑茶中多酚组分和多酚总量分析[J].蚕桑茶叶通讯，2011（2）：26-28.

[11] GBT8314-87，茶游离氨基酸总量测定[S].

[12] 方中达.植病研究法[M].北京：农业出版杜，1979.

[13] GB/T8305-1987，茶叶水浸出物测定国家标准[S].

[14] 程启坤.红茶色素的系统分析法[J].中国茶叶，1981（1）：17-18.

[15] 程启坤.红茶中的茶黄素[J].国外农学一茶叶，1983（1）：1-14

[16] 李银花，李  娟，杨新河.湖北青砖茶渥堆过程中主要生化成分的变化研究[J].农产品加工，2017（19）：44-47.

[17] 屠幼英，梁慧玲，陈  暄，等.紧压茶儿茶素和有机酸的组成分析[J].茶叶，2002（1）：22-24.

[18] 袁  玲，黄建安，龚志华，等.茯砖茶有机酸反相高效液相色谱分析方法建立及其应用[J].中国农学通报，2011，27（30）：24-252.

[19] 丁  玲.茯砖茶加工过程中主要化学成分的变化及其对胰酶活性的影响[D].杭州：浙江大学，2006.

[20] 陈文峰，屠幼英，吴媛媛，等.黑茶紧压茶浸提物对胰蛋白酶活性的影响[J].中国茶叶，2002（3）：16-17.

[21] GREENWALT C J，LEDFORD R A，STEINKRAUS KH. Determination and characterization of the antimicrobial activity of the Fermented Tea Kombucha[J].LWT-Food science and technology，1998，31（3）：291-296.

[22] 丁  建.不同因素对老青砖毛茶品质形成的影响[D].武汉：华中农业大学，2010.

[23] 岳随娟，刘  建，龚加顺，等.普洱茶茶褐素对大鼠肠道菌群的影响[J].茶叶科学，2016，36（3）：261-267.

[24] 李俊良，王淑琴，史彬林，等.柠檬酸对肉仔鸡生长性能、肠道菌群、肠黏膜形态及血液相关指标的影响[A].中国畜牧兽医学会动物营养学分会.中国畜牧兽医学会动物营养学分会第十一次全国动物营养学术研讨会论文集[C].北京：中国畜牧兽医学会动物营养学分会，2012.1.

[25] 翁  蔚，屠幼英，杨子银，等.茶饮料的抗生活性研究[J].茶叶，2004，30（2）：98-100.

[26] 虞希冲，杨  伟，吴波拉，等.茶氨酸经下丘脑腹外侧核抑制雌性小鼠摄食与胃排空作用研究[J].茶叶科学，2013（5）：429-435.

[27] 史先振，朱圣陶，贺  峰.木糖改善胃肠道保健功能的实验研究[J].食品与药品，2008（9）：40-42.

[28] 朱建鹏.健胃消食片原材料浸膏中多糖组分对胃肠道的功能作用[D].南昌：南昌大学，2016.

[29] 于  玲，赵常新.高效液相色谱法快速测定葡萄酒中有机酸[J].大连轻工业学院学报，1998，17（4）：84-86.

[30] 那淑敏，李金波.嗜酸乳杆菌发酵代谢产物分析[J].中国微生态学杂志，1999，11（5）：266-269.

收稿日期：2018-08-16

作者简介：唐  飞（1989-），男，湖南邵阳人，硕士研究生，研究方向为茶叶加工与功能化学，