孙永强　王　强　郑国静　孙　溪

[摘要]目的探讨罗非昔布对裸鼠人胃癌原位种植瘤组织中微血管密度(microvessel density，MVD)表达的影响。方法建立裸鼠人胃癌原位种植转移模型，随机分为生理盐水对照组、5-Fu化疗组、罗非昔布组及罗非昔布联合5-Fu化疗组(联合用药组)，生理盐水、罗非昔布灌胃给药，5-Fu腹腔注射给药，采用免疫组织化学Envision法检测各组原位种植瘤组织中MVD的表达。结果MVD计数结果显示，生理盐水对照组为56.8±9.8，5-Fu化疗组为39.9±7.0，罗非昔布组为42.3±11.0，联合用药组为25.1±7.6。罗非昔布组与生理盐水对照组之间、罗非昔布组与联合用药组之间比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论环氧合酶-2抑制剂罗非昔布可以通过降低胃癌肿瘤组织中MVD的表达，使胃肿瘤血管生成受到抑制；与化疗药物联合应用增加其抑制血管生成作用。

[关键词]罗非昔布；胃癌；裸鼠；原位移植；微血管密度

胃癌的生长、转移与复发是血管生成依赖性的。有资料表明，环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，Cox-2)的过度表达能促进肿瘤的新生血管生成，为肿瘤生长和转移提供所必需的营养。而Cox-2抑制剂可明显抑制这些促血管生成因子的表达。本实验旨在通过建立裸鼠人胃癌原位种植转移模型，采用高选择性Cox-2抑制剂罗非昔布灌胃，检测肿瘤组织中的微血管密度(MVD)表达情况，初步探讨罗非昔布对肿瘤新生血管生成的影响，为非甾体类抗炎药(nonsteroidal anti-in－flammatory drugs，NSAIDs)的抗肿瘤应用提供理论基础。

1　材料和方法

1.1　材料与试剂

BALB／C nu／nu裸鼠32只(由中国医学科学院国家啮齿类上海实验分中心提供)，雌雄不限，6周龄，体重18－20g，SPF级动物实验室条件下饲养。人胃腺癌SGC-7901细胞株(由中国医学科学院上海细胞生物研究所提供)制成2×10⁶细胞悬液，于裸鼠腋部皮下注射，成瘤后反复传代至形成实体瘤，本组瘤源为第6代。罗非昔布为杭州默沙东制药有限公司产品，每片25mg。

主要试剂：兔抗人CD34一抗(美国Neomarkers公司，稀释度为1：50)；即用型Envision试剂(二抗，丹麦Dako生物制品有限公司，批号K4001)；10％多聚赖氨酸(Sigma生物制品有限公司)。以PBS为一抗设阴性对照，以丹麦Dako生物制品有限公司提供的阳性切片为阳性对照。

1.2　方法

1.2.1　人胃癌裸鼠原位种植模型的建立取传代后14d的荷瘤鼠，常规消毒，从腋部皮下剥取肿瘤组织，剔除纤维包膜，切开选取生长良好、呈淡红色、鱼肉状的瘤组织，切成1mm×1mm×1mm小块备用。

实验动物术前禁食，以氯胺酮50mg·kg^-1腹腔麻醉，皮肤消毒，左侧旁正中切口进腹，在胃窦小弯近胃角处用无菌缝合针头划破胃壁浆肌层，植入1块瘤组织于凹内，并在瘤块表面滴上l滴OB生物胶，凝固后回纳入腹腔，逐层关腹。以上操作均在超净台内进行。模型建立后12周将裸鼠拉颈处死，解剖动物，取移植瘤用10％福尔马林固定，组织切片、染色后行光镜下常规病理学检查。

1.2.2　实验动物分组及给药在种植术后1周，将存活的裸鼠随机分4组，每组8只。即生理盐水对照组(生理盐水0.2ml灌胃，每日1次)、5－Fu化疗组(5－Fu60mg·kg^-1腹腔注射，每周1次)、罗非昔布组(罗非昔布5mg·kg^-1灌胃，每日1次)和罗非昔布联合5-Fu化疗组(联合用药组，罗非昔布和5-Fu用法同前)，4组均连续给药8周。联合用药组裸鼠于用药后第4周和第8周各死亡1只。

1.2.3　肿瘤组织中MVD的检测采用免疫组织化学Envision法检测各组原位种植瘤组织中MVD的表达。根据Weidner等的方法，每张染色切片在100倍镜下寻找3个微血管密度最高区，即所谓“热点”，然后在200倍视野下计数染成棕色的血管数目，每例标本分别计数3个视野，取平均值。单个红染内皮细胞或内皮细胞堆集(无论有无管腔形成)均参与计数。管腔较大且有较厚肌层或管腔内有8个以上红细胞不在计数之列。

1.3　统计学处理

计数资料表示，应用SAS6.12统计软件，多样本均数间比较采用方差分析，两两之间比较采用SNK-q检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组胃癌组织MVD表达

每张胃癌切片内的微血管均得到很好显示，阳性部位位于血管内皮细胞，癌组织内见较多微血管深染，呈棕褐色，逗点状、小管状或条索状，肌间血管也清晰可辨。

3 讨论

肿瘤的生长和转移依赖于血管生成，丰富的血管向肿瘤提供充足的营养，为其增殖、侵袭和转移提供必要的物质条件，因此，MVD是影响肿瘤生物学行为的一个重要因素。

胃癌组织边缘的微血管多呈簇状和发芽状生长，且血管数量远高于癌中央区域，这反映了癌细胞浸润与发展的方向。肿瘤中微血管的形态结构也存在明显缺陷：新生的微血管基底膜不完整，有较大裂隙，使肿瘤细胞能够容易地侵入而产生转移。与此同时，MVD高表达者易发生转移或复发，预后差；高表达MVD患者即使行根治性切除，发生转移的机会也远远大于MVD低者。因此，现在多数观点认为，肿瘤组织的MVD是影响患者生存的独立预后因素。

NSAIDs用于临床已有百年，其作用机制为通过抑制环氧合酶(cyclooxygenase，Cox)而减少对前列腺素(PG)合成的催化作用。大量的流行病学调查显示，NSAIDs对肿瘤有预防作用，规则地服用阿司匹林和其他NSAIDs可使大肠癌的危险率减少40％－50％。研究显示Cox有两种同工酶，即Cox-1和Cox-2，其中Cox-1主要参与调节组织器官内生理性前列腺素，Cox－2是一种诱生性表达的蛋白，在正常状态下Cox-2的活性很低，主要与炎症、肿瘤等病理过程有关。

多项研究显示，Cox-2过度表达在胃癌的形成中起重要作用。Cox-2的过度表达可促进肿瘤的新生血管生成，而抑制Cox-2的表达有可能预防和逆转肿瘤的发生。因此，应用Cox-2抑制剂可能成为治疗和预防肿瘤的里程碑。

本实验结果显示：罗非昔布组与生理盐水对照组相比，MVD差异有统计学意义；联合用药组与其他各治疗组相比，MVD表达差异也有统计学意义。提示罗非昔布可以明显减少肿瘤微血管的生成，与5－Fu联合使用可以增加化疗药抑制肿瘤微血管生成的作用，这为高选择性Cox-2抑制剂在抗肿瘤方面的应用提供了理论依据，同时也可能为恶性肿瘤的治疗开辟一条新的途径。