【摘要】目的本研究拟通过研究PTEN在肝癌组织中的表达情况，分析PTEN与肝癌肿瘤大小、分化程度、浸润深度、临床分期、淋巴结转移情况等临床病理特征之间的关系。方法选取笔者所在医院普外科2005年9月～2010年9月期间手术切除的50例肝癌组织，采用免疫组织化学法检测PTEN在肝癌组织和正常肝组织中的表达水平以及其在肝癌不同临床病理情况中的表达水平。统计学处理采用SPSS 160统计软件。结果(1)在肝癌的分化程度、淋巴结转移、浸润深度、临床分期等这些病理因素方面，PTEN的表达存在着显著差异，但是在肿瘤的大小方面，两者间的表达并无统计学意义。(2)伴有淋巴结转移的PTEN表达强度低于无淋巴结转移的PTEN表达强度,两者比较差异有统计学意义。结论(1)PTEN在肝癌组织表达强度低于正常肝组织，且与肝癌的分化程度、TNM分期以及肿瘤的浸润深度有关，提示PTEN参与了肿瘤分化以及侵袭过程。同时PTEN在有淋巴结转移和无淋巴结转移的肝癌组织中的表达存在明显差异。(2)肝癌组织中PTEN表达参与了肝癌的侵袭与转移。

【关键词】肝癌；PTEN；临床意义

PTEN expression in hepatocellular carcinoma and its clinical significance ZHAO Shi-fu,ZHAO Yu-ling,LIU Shu-feng.Weifang Medical College,Weifang 261053,China

【Abstract】ObjectiveThis study observes PTEN expression in hepatocellular carcinoma and analysis the relationship between PTEN and clinical pathological features, liver tumor size, degree of differentiation, depth of invasion, clinical stage, lymph node metastasis.MethodsTo select 50 cases of HCC tissues of surgery which from in authors hospital from September 2005 to September 2010, the expression of PTEN in HCC tissue and normal tissues and in the different times of HCC tissues clinical pathological situations were detected by immunohistochemical experimental statistical analysis using SPSS 160 statistical software. Results(1)in the differenttiation of liver cancer, lymph node metastasis, depth of invasion, clinical stage of these pathological factors, PTEN expression exist significant differences, but the size of tumor expression was not statistically significant.(2)PTEN expression intensity with lymph node metastasis lower than without lymph node of PTEN expression,the difference was statistically significant.Conclusion(1)PTEN expression in hepatocellular carcinoma and intensity lower than normal liver tissue with HCC differentiation,TNM stage and tumor depth of invasion, suggesting that PTEN involved in cell differentiation and invasion processes.At the same time PTEN expression in lymph node metastasis and without lymph node metastasis of liver cancer tissues significant differences.(2)Hepatocellular expression of PTEN involved in cancer invasion and metastasis.

【Key words】Liver cancer；PTEN；Clinical significance

近年来，在分子水平上对于肿瘤生物学行为的研究取得了巨大的进展，人们已认识到细胞凋亡与增殖之间的动态平衡是促进个体生长发育，维持机体稳态的重要方式。在肝组织中，肝细胞凋亡抑制和增生异常是细胞癌变、肿瘤无限生长的主要原因，其中抑癌基因在维持细胞凋亡和增殖之间的动态平衡中起重要作用。目前研究发现，抑癌基因PTEN的失活或突变与肿瘤发生、浸润及转移等病理过程关系密切［1,2］，PTEN定位于染色体10q23［3］，以活性状态和非活性状态两种形式存在。抑癌基因PTEN在肿瘤发生、转移中作用日益受到关注。本研究采用免疫组化SP法，检测正常肝组织、癌周组织以及肝癌组织中PTEN的表达，探讨二者与肝癌临床病理之间的关系及二者之间的相互关系，为肝癌发生浸润和转移的预测、预后判断提供依据，以进一步探讨肿瘤浸润转移可能机制，寻找治疗有效靶点，进而有效治疗肿瘤的转移。

1资料与方法

11一般资料选取2005年10月～2010年10月在解放军89医院诊治的50例肝癌患者，其中男38例，女12例，年龄38～75岁。肿瘤位于肝窦者29例，肝体者14例，肝底者7例。肿瘤直径大于5 cm者31例，小于5 cm者19例。分化程度：高分化组19例，中分化组21例，低分化组10例。TNM分期：Ⅰ期12例，Ⅱ期21例，Ⅲ期13例，Ⅳ期4例。肿瘤浸润未超过浆膜层者23例，超过浆膜层者27例。有淋巴结转移者34例，无淋巴结转移者16例。50例癌旁组织取自标本切缘正常组织。

12方法

121试剂与仪器生物光学显微镜（日本OLYMPUS公司)；IM-2型病理组织包埋机（安徽电子科学研究所）；石蜡切片机（德国Leica RM2135）；QP-BS切片漂烘温控仪（安徽电子科学研究所）；WMK-08型电热恒温培养箱（山东潍坊医疗设备厂）；BX-51全自动显微照相系统（日本OLYMPUS公司)；一抗：PTEN鼠抗人单克隆抗体（北京中山生物公司）；二抗：通用型PV-9000二步法免疫组化试剂盒（北京中山生物公司）；DAB显色试剂盒（北京中山生物公司）。

122实验方法HE染色，水洗，苏木素染色，充分水洗，盐酸酒精分色，充分水洗，氨水蓝化，充分水洗，脱水，伊红染色，脱水、透明，中性树胶封片，免疫组化PV-9000二步法检测PTEN肝癌组织中的表达，微波修复抗原，3%的H2O2室温孵育，PBS冲洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，PBS冲洗，滴加生物素标记的第二抗体，滴加链霉素抗生物素蛋白一过氧化酶溶液，PBS冲洗，每张切片滴加新鲜配制的DAB溶液，PBS冲洗，复染，梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，镜下观察。

13统计学处理采用SPSS 160统计软件包进行卡方检验，以α=0.05为检验水准，分析PTEN在肝癌组织中的表达有无统计学意义。

2结果

PTEN表达的50例肝癌标本中，高分化、中分化、低分化三组中，高分化19例，中分化18例，低分化13例，高中分化组表达明显高于低分化组，两组间的表达差异有统计学意义，在淋巴转移方面，50例中伴淋巴结转移者31例，不伴淋巴结转移者19例，两者表达比较差异有统计学意义。在浸润深度方面，50例中未侵及浆膜者19例，侵及浆膜者31例，统计分析，二者之间的表达差异有统计学意义。临床分期，Ⅰ期＋Ⅱ期32例，Ⅲ期＋Ⅳ期18例，二者间的表达差别有统计学意义。在肿瘤大小方面，肿瘤直径大于5 cm者26例，小于5 cm者24例，两者之间的表达有统计学意义。在肝癌的分化程度、淋巴结转移、浸润深度、临床分期等这些病理因素方面，PTEN的表达存在着显著差异，但是在肿瘤的大小方面，两者间的表达并无统计学意义。

3讨论

1997年美国3个实验室［4～6］先后在第10号染色体的同一位点发现的一种新的肿瘤抑制基因，将其命名为PTEN基因，亦称在多个进展期中均有突变的基因(mutated in multiple advancedcancers 1, MMAC1)。近年来研究发现，PTEN在肿瘤细胞中的表达异常，提示其在肿瘤的浸润以及转移机制中发挥重要作用。PTEN可以发挥抑制肿瘤发生的作用，该基因的肿瘤抑制作用是通过对PIP3去磷酸化、拮抗PI3K/Akt通路而实现的。蛋白激酶B为PTEN重要的效应分子。蛋白激酶B(AKT)可以介导PI3K的许多生物学效应，在PI3K/Akt信号通路中起核心作用。AKT聚集于细胞膜，并且与PIP3高特异性、高亲和力结合。通过这一结合作用使AKT磷酸化，从而激活AKT。活化的AKT又可使胞浆及胞核内的一系列底物发生磷酸化，如GSK3、IRS-1、 PDE-3B、 BAD、human Caspase9、 Forkhead、 NF-KB、 mTOR、 eNOS、 Raf蛋白激酶等，从而发挥其活性作用。PTEN具有双特异性磷酸酯酶活性，可以通过使PIP3去磷酸化形成PIP2，降低PIP3水平这一途径来阻断PI3K/AKT通路，促进细胞凋亡。Tamura等［7］在实验中发现，PI3K抑制剂如Wortmannin可以模拟PTEN作用于细胞周期以及p27蛋白水平，证实了PTEN是通过抑制PI3K/Akt信号通路从而促进细胞凋亡。PTEN的诱导细胞凋亡作用的另一途径与Integrin有关。PTEN在使关键的信号传导脂类脱磷酸化中起重要作用。当PTEN蛋白表达缺失时，此类脂类信号传导通路将使肿瘤细胞避免凋亡。PTEN可以抑制脂类磷酸酶活性，拮抗细胞与细胞外基质之间的相互作用，从而维持了细胞对凋亡的敏感性，在肿瘤的形成过程中，在PI3K/Akt和mitogen激活的蛋白激酶通路中，胰岛素样生长因子系统(IGF)起重要作用。Hwang等［8］通过对人类肝腺癌细胞株SUN-5和-216转染人类PTENcDNA，以评估PTEN基因在肝癌中对细胞生长及胰岛素样生长因子系统的效应。PTENcDNA转染的类肝腺癌细胞株表现出了较低的增殖率。PTEN在SUN-5和SUN-216细胞株中过度表达，并且对有etoposide、adriamycin损伤DNA诱导的死亡更加敏感。他们认为通过调节IGF系统，PTEN基因抑制肿瘤细胞的生长，并增加了肿瘤细胞对抗癌药物的敏感性。

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是消化系统最常见肿瘤之一。近二十年来我国肝癌的死亡率增加了4117%，已成为我国第二位的肿瘤致死病因。有关HCC的影像学、手术、放化疗、肿瘤的局部治疗及生物治疗等方面都一些进展，但HCC的远期治疗效果无明显变化。目前，肝癌的发病率和死亡率仍然居高不下，由于肿瘤发病的多阶段性以及各相关因素之间交互作用的复杂性，一级预防很难在实际工作中开展。为了调查PTEN/MMAC1在肝癌的发生发展上的潜在作用，Khanna［2］等对96例肝癌患者进行10q等位基因缺失和PTEN/MMAC1基因所有编码区域微小突变的检查。结果显示96例患者中有5例检测到体细胞的突变。其中3例发生移码突变，1例在外显子4的83和84密码子处有1个碱基对的插入，2例在外显子8的318和319密码子处存在4个碱基对的缺失；另外2例有CG的颠换突变，发生在外显子1从起始密码子开始的第5非编码区的第9碱基对，但96例病人中没有发现PTEN基因的错义突变。这些发现表明，如果1个等位基因内的点突变和另一个染色体材料的丢失同时发生，PTEN/MMACI基因中就有2个等位基因被阻止。Southern杂交结果显示，所有34例肝细胞癌组织中未观察到PTEN基因限制性片段长度多态性或该基因纯合性缺失、半合性缺失和片段缺失。PCR-SSCP检测发现，有2例肝细胞癌PTEN基因第5外显子均显示有1条额外电泳迁移带，异常迁移带位置相同，提示第5外显子突变位点可能相同，但Yeh等［9］通过应用嵌合RNA的RT-PCR技术和外显子SSCP分析检测了42例原发性肝癌的PTEN/MMACI突变，42例中没有1例出现该基因的微小缺失、点突变或插入突变，其结果表明PTEN/MMACI基因在肝癌的发病机制上不起任何作用。

总之，肝癌的浸润和转移是一个多阶段、连续、复杂的病理过程。随着对抑癌基因PTEN的研究的深入，其与肿瘤转移的密切相关性已为越来越多的研究者所认同，目前可以肯定PTEN在促进肝癌转移方面，存在着多种复杂机制。PTEN也很可能通过多种途径增强肝癌的侵袭与转移。

参考文献

［1］Yu Y, Khan J, Khanna C, et al.Expression profiling identifies the cytoskeletal organiz-er PTEN and the developmental homeopmental homeoprotein Six-1 as key metastatic regulators.Nat Med,2004,10(2):175-181

［2］Khanna C, Wan X, Bose S, et al.The membrane cytoskeleton linker PTEN is necessary for osteosarcoma metastasis. Nat Med, 2004, 10(2):182-186

［3］Tachibana M, Shibakita M, Ohno S, et al.Expression and prognostic significance of PTEN product protein in patients with esophageal squamous cell carcinoma.Cancer,2002,94(7):1955-1960.

［4］Johnson G, Lapadat R.Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK, JNK and p38 protein kinases. Science, 2002,298(5600):1911-1912

［5］Morrison DK.KSR: a MAPK scaffold of the Ras pathway. J Cell Sci,2001, 114(Pt 9): 1609-1612

［6］Davies MA, Lu Y, Sano T, et al.Adenoviral transgene expression of MMAC/PTEN in human glioma cells inhibits Akt activation and induces anoikis. Cancer Res, 1998, 58(23):5285-5290.

［7］Tamura M, Gu J, Tran H, et al.PTEN gene and integrin signaling in cancer. J Natl Cancer lnst, 1999,91(21):1820-1828

［8］Laughner E, Taghavi P, Chiles K, et al.HER2 (neu) signaling increases the rate of hypoxia-inducible factor 1alpha (HIF-1alpha) synthesis: novel mechanism for HIF-1-mediated vascular endothelial growth factor expression. Mol Cell Biol, 2001,21(12):3995-4004

［9］Stocker H,Andjelkovic M,Oldham S,et al.Living with lethal PIP3 levels: viability of flies lacking PTEN restored by a PH domain mutation in AKT/PKB.Science,2002,1295(5562):2088-2091