内容摘要：打开文本图片集[摘要]为了提供塞隆骨药材资源地理分布的准确资料，研究对青藏高原地区的鼢鼠物种进行了分
![zoޛ)j馐\,77^4n2ym8no9M̭oiv^4]Mz7ןt{߮)x!j'Sz]|o5I\ߖuw(%y˥j'*'Z' ح{iv+-&*'t](http://img.qikan.com.cn/qkimages/zgyi/zgyi201503/zgyi20150306-1-l.jpg)
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1材料
于2008—2012年用地箭捕捉鼢鼠，解剖后取大腿肌肉样品，用95%乙醇固定。记录采集地经纬度、海拔等信息。从35个采样点中共采集503份鼢鼠个体，涉及青海、甘肃、四川3省，具体采样信息及地理分布见表1。试剂包括动物组织DNA提取试剂盒（上海生工），Taq酶及PCR缓冲液（含Mg2+）（全式金），超纯水（自制）等。
2方法
2.1DNA提取、PCR扩增与测序取肌肉0.1 g左右，置于灭菌玻璃板上切碎，按照试剂盒说明书步骤提取基因组总DNA。Cytb基因的PCR扩增在Tgradient Thermocycler（Biometra）上进行，参数设置为：95 ℃条件下预变性3 min;95 ℃变性45 s，54 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，34 次循环;最后72 ℃续延伸7 min。反应体系为50 μL，内含200 mmol·L<sup>-1</sup> dNTP，每条引物0.2 mmol·L<sup>-1</sup>，1 U Taq酶及1 μL DNA 样本。正向引物L14724 （5′-CGAAGCTTGATATGAAAAACCATCGTTG-3′），反向引物H15917（5′-CGGAATTCCATTTTTGGTTTACAAG-3′）。扩增产物直接送上海生工进行测序，测序仪型号为ABI 3730 DNA Analysis System （Applied Biosystems，USA）。
2.2数据处理测序数据经Chromas 软件输出后，用Clustal X软件<sup>[11]</sup>的默认参数设置进行同源排序，并实施人工校对，最终得到可用序列以供进一步分析 。以DnaSP v5软件<sup>[12]</sup>统计序列变异位点信息，并输出单倍型和遗传多样性信息。
系统发生关系用最大似然法（maximum likelihood，ML） 和贝叶斯法（Bayesian inference，BI），分别用Phyml 3.1软件<sup>[13]</sup>和MrBayes 3.2.2软件<sup>[14]</sup>进行。在构建系统树之前，先用jModeltest软件<sup>[15]</sup>对所有单倍型序列进行模型测试，以Akaike information criterion（AIC）指数为指标，获得最适模型及相应的统计学参数。对ML法的分枝置信度进行100次Bootstrap自举检验;而对于BI法则设置2百万代（generations），保证其分裂频率标准偏差（standard deviation of split frequencies）小于0.01。构建系统树时，以平颅鼢鼠属的东北鼢鼠Myospalax psilurus作为外类群。同时，作者从GenBank下载已进行物种鉴定的凸颅鼢鼠序列<sup>[6]</sup>参与建树，用以判定本研究所测序列的物种属性。值得一提的是，这些已知序列中有部分两两之间完全相同，本研究仅随机保留其中1条。
3结果与讨论
对503个样品进行测序，得到1 140 bp长度的cytb基因全序列。共检测到311个变异位点，总体表1采样点、样本量及单倍型分布信息
Table 1Sampling sites， sample size， and haplotype distribution of zokors
地点简称经度纬度海拔/m样本量单倍型物种青海省班玛县多贡麻乡BM100°33′49.932″33°7′28.308″3 70514H1-H4Eb青海省称多县珍秦乡CD197°14′7.404″33°21′12.816″4 39013H5Eb青海省称多县歇武镇CD297°28′21.792″33°12′5.508″4 45014H6-H9Eb青海省称多县清水河镇CD396°56′37.392″33°46′10.704″4 55014H10Eb青海省大通县向化乡DT1101°47′20.688″37°9′7.308″2 98819H11-H23Eb青海省大通县黄家寨镇DT2101°43′3.972″36°50′29.148″2 3937H24-H26Eb+Ec青海省刚察县泉吉乡GC99°42′41.400″37°10′9.408″3 23514H27-H29Eb青海省贵德县尕让乡GD101°33′14.112″36°17′57.732″3 11911H30-H33Eb青海省共和县石乃亥乡GH99°44′5.928″37°2′1.752″3 20914H27Eb青海省贵南县过马营镇GN1101°4′8.868″35°46′32.088″3 25517H34-H39Eb青海省贵南县塔秀乡GN2100°27′42.588″35°34′38.568″3 30619H40-H44Eb青海省贵南县过马营镇GN3101°18′4.392″35°46′2.820″3 30212H36，H45-H47Eb青海省化隆县巴燕镇HL102°17′49.668″36°11′18.528″3 18514H48-H54Eb青海省河南县优干宁镇HN101°33′35.172″34°46′29.568″3 55214H55-H58Eb青海省湟源县大华乡HY101°4′41.412″36°39′16.560″3 04316H30，H59-H66Eb青海省互助县松多乡HZ1102°11′47.328″36°42′14.148″2 88010C27-C29Ec青海省互助县巴扎乡HZ2102°15′21.600″37°2′7.260″2 85715H67-H72Eb青海省久治县智青松多镇JZ1101°29′29.580″33°15′35.568″3 74117H73-H76Eb青海省久治县索呼日麻乡JZ2100°49′19.632″33°36′17.892″3 84714H77-H80Eb青海省乐都县下北山林场LD102°38′15.288″36°34′54.588″3 00011C30-C33Ec青海省民和县满坪镇MH1102°43′40.188″36°2′54.492″2 67011C34-C38Ec青海省民和县川口镇MH2102°49′16.248″36°15′30.240″2 31313H81-H84Ec青海省门源县东川镇MY101°49′31.620″37°19′24.528″2 71515H85-H86Eb青海省平安县寺台乡PA101°58′2.064″36°22′27.480″2 75011C39-C40Ec青海省祁连县八宝镇QL1100°11′35.340″38°6′14.688″3 21314H87-H90Eb青海省祁连县默勒镇QL2100°31′31.872″37°39′34.488″3 56616H27，H91-H95Eb四川省若尔盖县阿西乡REG2102°53′24.000″33°54′53.496″3 45014H96-H100Eb四川省若尔盖县唐克乡REG3102°31′59.916″33°24′36.900″3 49015H101-H102Eb四川省若尔盖县红星乡REG4102°43′16.608″34°6′11.088″3 24012H103-H109Eb青海省天峻县关角乡TJ98°52′15.492″37°10′46.704″3 84014H110-H114Eb青海省兴海县河卡镇XH99°55′7.320″35°51′10.728″3 56614H115-H116Eb青海省泽库县巴滩牧场ZK100°57′42.192″35°14′15.540″3 42825H38，H117-H124Eb甘肃省卓尼县啊子滩乡ZN1103°14′49.740″34°44′58.632″3 16023H125Eb甘肃省卓尼县完冒乡ZN2103°3′8.352″34°22′2.532″3 27012H125，H126-H131Eb甘肃省卓尼县申藏乡ZN3103°33′6.984″34°44′21.444″3 02015H125，H132-H136Eb+Es注：Eb.高原鼢鼠;Ec.甘肃鼢鼠;Es.斯氏鼢鼠。
赵芳等：青藏高原地区塞隆骨资源的分子鉴定和地理分布单倍型多样性（Hd±SD）为0.986±0.001，核苷酸多样性（Pi±SD）为0.062 38±0.001 23。从503个序列中共检测到150个单倍型，其中有5个单倍型在2～3个种群之间共享（H27，H30，H36，H38，H125）。各种群的单倍型组成在表1中列出，其中H1～H136对应GenBank号KM103774～KM103909，C27～C40对应GenBank号GQ244389～ GQ244402。
系统发育分析显示，ML，BI 这2种方法得到系统树的结构非常相似。结果表明，有20个单倍型（C27～C40，H024，H026，H081～H084）与现有甘肃鼢鼠形成单系群，有4个单倍型（H132～H134，H136）与斯氏鼢鼠构成单系群，其余126个单倍型（84%）与已知高原鼢鼠序列形成单系群，见图1。基于系统树和单倍型分布特征可以判定，HZ1，LD，MH1，MH2，PA种群中所有个体都是甘肃鼢鼠，DT2种群中同时具有甘肃鼢鼠和高原鼢鼠个体，ZN3种群中同时具有高原鼢鼠和斯氏鼢鼠个体，其他28个种群中所有个体都为高原鼢鼠（表1）。
A. 最大似然树;B. 贝叶斯树。
图1基于单倍型构建的系统发育树
Fig.1Phylogenetic trees based on zokor cytb haplotypes
本研究显示，青藏高原地区绝大多数种群都由高原鼢鼠组成，同时还有部分地区为甘肃鼢鼠、高原鼢鼠+甘肃鼢鼠、高原鼢鼠+斯氏鼢鼠种群。从分布区域上看，湟水河流域是甘肃鼢鼠的主要分布区，与多个高原鼢鼠分布区域接壤，最容易导致混淆。同时，县域并非判定鼢鼠物种的良好指标，如大通县和互助县分别都有高原鼢鼠和甘肃鼢鼠2个物种分布，而卓尼县则有高原鼢鼠和斯氏鼢鼠2个物种分布。从海拔上看，3 100 m以上区域只有高原鼢鼠分布，可以作为相对准确的判断标准，而3 100 m以下地区则3种鼢鼠都可能分布，不能作为判定依据。
之前的研究表明，鼢鼠属的物种进化过程具有异域发生的特点，称多地区（CD1～CD3）是迄今为止发现的高原鼢鼠最古老类群，之后向北向东扩散、分化<sup>[16]</sup>。而甘肃鼢鼠的古老类群则在陕西北部地区，之后向西扩展<sup>[10]</sup>，最后在青藏高原和黄土高原交汇的湟水河谷与高原鼢鼠汇合。斯氏鼢鼠的模式产地在甘肃省临潭县<sup>[6]</sup>，作者推测，本研究的ZN3种群也是斯氏鼢鼠向高原扩散并与高原鼢鼠汇合的地点。总体来看，青海湖地区和黄河贵德段上游地区可以保证都是高原鼢鼠。本研究表明，利用cytb鉴定鼢鼠种类完全可行，为保证塞隆骨药材的正宗性，建议利用此标记进行分子鉴定。
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[责任编辑吕冬梅]
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