【中图分类号】R68 【文献标识码】A 【文章编号】2095-6851（2017）03-0-01

缺血性心脏病（ischemic heart disease，IHD），即冠状动脉粥样硬化性心脏（coronary atherosclerotic heart disease ），指冠状动脉粥样硬化或（和）冠状动脉功能性改变使血管腔狭窄或阻塞，导致心肌缺血缺氧或坏死而引起的心脏病。随着经皮冠状动脉介入治疗（Percutaneous coronary intervention ，PCI）和冠状动脉搭桥术（CABG）广泛应用于临床，IHD治疗效果明显，但对于严重的IHD，如弥散性病变及梗死区远端心肌坏死、血管阻塞等，通过现有治疗手段患者即使可以渡过急性期，因心肌再生能力不足，坏死心肌纤维化、瘢痕化仍不可逆转，导致心力衰竭等严重并发症的发生。近年，干细胞移植研究给心血管疾病带来了新的曙光。其中，骨髓间充质干细胞（陈雨bonemarrow mesenchymal stem cells， BMSCs ）由于其来源广泛、容易获取、扩增能力强、多项分化潜能、易与宿主细胞建立联系及免疫原性低、能归巢、无医学伦理学争议等[1]优越性被大量前临床研究用于缺血性心脏病的细胞治疗。

1.骨髓间充质干细胞（bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs）的概述：

血BMSCs属于骨髓干细胞中的一种，具有高度自我更新能力和多向分化能力的成体干细胞群体，最早于1987年，Friendenstein等[2]發现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化成为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞，而且这些细胞经过20～30个培养周期后仍能保持其多向分化潜能；研究显示，人BMSCs在体外用5-氮胞苷（5-aza）处理24小时后可诱导成心肌细胞[3]Wang等人观察到在“环境诱导分化“的作用下，不经5-aza处理的BMSCs在体内可分化为心肌细胞并与宿主心肌细胞之间形成闰盘联系[4]。该类骨髓间充质干细胞不表达造血细胞系标记CD14、CD34、CD45及CD133，不表达内皮细胞系标记如vonWillebrand因子、P选择蛋白，而表达CD105、CD90及CD166抗原。后来的研究发现在体外培养条件下，BMSCs还具有向其他胚层细胞方向分化的能力，如肌腱、脂肪、肌肉、内皮、神经及心肌细胞等[5][6]。

2.取材：

不同组织来源的间充质干细胞的表型、增值分化能力和基因表达有一定差异，骨髓间充质干细胞占有核细胞总数的0.001%—0.010%，并随着年龄的增大而减少[7]，为实验研究的方便性和可行性，宜取幼龄小型哺乳动物的长骨骨髓。

3.分离纯化及鉴定

目前对于骨髓间充质干细胞的分离纯化常用的方法有：贴壁细胞离心法、密度梯度离心法、流式细胞仪法与免疫磁珠分离法等。贴壁细胞分离法是根据骨髓间充质干细胞贴壁生长的特性，通过反复换液去除悬浮细胞，使其与造血干细胞分离。培养所得的原代骨髓间充质干细胞贴壁增殖快，细胞活性高，缺点是所得细胞成分复杂，分离难度高。密度梯度离心法是根据骨髓间充质干细胞与其他细胞的密度差异进行细胞分离。这种方法与贴壁分离法结合，分离得到的细胞纯度相对更高，获得广泛采用。免疫磁珠分离法是利用的表面特异性抗原，利用免疫磁珠进行分离，它是目前所能获得BMSCs纯度最高的方法。[8]但由于BMSCs表面缺乏特异性标志，及分选后的细胞出现了增殖缓慢等问题，而且费用昂贵、操纵复杂、目前应用较少[9]。由于间充质干细胞表面具有多种标记物，但目前尚未筛选到独有的标志分子，给间充质干细胞的鉴定带来可一定的困难，2006年，国际细胞治疗协会提出了关于间充质干细胞鉴定的最低标准，包括3方面内容：在标准培养条件下能贴塑料瓶壁生长。95%以上的细胞表达CD105、CD73、CD90，同时95%以上的细胞不表达CD45、CD14或CD11b、CD79a或HLA-DR。能分化为骨细胞、脂肪细胞及软骨细胞。

4.预处理：

4.1 低氧处理：间充质干细胞在培养基中一般呈单细胞层生长，在低氧条件下，其增扩率可增加30倍。低氧条件下预处理BMSCs能增强BMSCs对心肌细胞凋亡的保护作用。

4.2 基因转染MSCs：目前认为血管内皮生长因子（VEGF）是最有效刺激血管生成的细胞因子之一，人类至少有4种VEGF，分别由121、165、189和206个氨基酸组成，其中VEGF165是发挥生物学效应的主要成分。Carmeliet等人发现VEGF表达水平对获得性血管生成是非常重要的。VEGF基因转染的MSCs能分泌较高水平的VEGF。研究显VEGF基因转染的MSCs移植在1个月后能产生较强的成血管反应，导致血管密度显著增加，且绝大多数新生血管是宿主源性的。

由于新生血管受多种生长因子的调控，单一生长因子生成的血管存在不稳定和易渗漏问题，联合基因治疗是非常重要的。缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）是细胞在缺氧条件下产生的具有转录活性的蛋白，不仅可以结合多种促血管因子如血管内皮生长因子（VEGF）、转化生长因子β（TGF-β）等及其受体基因启动子上的缺氧反应元件，从而增强相应蛋白表达，启动血管新生的过程，提高血流灌注。

4.3 胰岛素样生长因子（insulin-likegrowthfactor-1，IGF-1）具有诱导细胞增殖、移植细胞凋亡、缓解心力衰竭过程中心肌细胞外基质重构作用的一类生长激素。研究显示IGF-1预处理的MSCs对心肌梗死后心肌有显著的抗炎作用，并且IGF-1预处理通过增强MSCs归巢效率及抗炎作用进一步提高心肌再生能力。

4.4 信号通路：MSCs中存在分化为各种功能细胞的目的基因，在分化的不同阶段，会有不同的基因表达，这种事件是随机的受微环境、细胞因子及信号通路的影响。如果加入诱导因子或细胞及信号通路调节子，增强目的基因表达，抑制其他基因的表达，就可使干细胞向目的细胞分化。目前有学者研究表明Notch信号通路对于干细胞分化为心肌细胞起着重要的调节作用。

5.移植途径的选择：

（1）经外周静脉注射：操作简单，与干细胞归巢有关，但也存在以下缺点细胞在血中循环时间较其他方法长，存在滞留现象，丢失的数量也较多；对其它脏器有影响，在肺、肝、脾中发现标记的干细胞；归巢有赖于趋化因子的浓度梯度，如心肌梗死时间过久，归巢的效果会受到影响；④异种的细胞移植不能用此种方式。（2）经冠状动脉注入：经心导管将MSCs选择性的直接注入缺血损伤区域的冠状动脉，MSCs易于进入损伤心肌内，为干细胞归巢提供了有利条件，但晚期缺血性心脏病患者冠状动脉增厚，MSCs无法通过细胞壁，移植效果欠佳，且目前可行性差。（3）骨髓动员：并不对干细胞进行分离、培养及灌注，而是应用粒细胞集落刺激因子、干细胞因子静脉注射使来自骨骼的干细胞、祖细胞进入血液，方法简单，但动员的细胞并非BMSCs一种，实验中也难以确定细胞进入血液的细胞的量（4）心肌内注射：心肌内注射分为心外膜注射和经心内膜注射。心内膜注射法定位虽然更加准确，但对技术水平和设备要求高，目前临床广泛开展困难；开胸在直视下对梗死区域心肌进行MSCs移植的心外膜法，定位性好，Zhang等报道该途径可使MSCs准确移植于梗死区及周边区，最大限度的达到细胞移植的效果，改善移植后患者心功能的恢复。

6.6 骨髓间充质干细胞治疗缺血性心脏病的机制：（1）分化为心肌：骨髓间充质干细胞多通过磷脂酰肌醇-3激酶（PI3-K）/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶途径参与心肌细胞分化。PI3-K是一种与细胞信号转导有关的胞内蛋白激酶，可被多种细胞因子激活。目前研究最多的细胞因子是转化生长因子-β（TGF-β）和骨形态发生蛋白2（BMP-2）。（2）促进血管新生，改善心肌血液供应：BMSC已经被证实可以分化为血管内皮细胞、平滑肌细胞等血管结构细胞，这些细胞参与血管发生、发育及生成。[21]（3）旁分泌机制：旁分泌机制依赖于骨髓间充质干细胞各种因子的释放，包括血管内皮生长因子（VEGF）、肝细胞生长因子和基质细胞源性生长因子，通过组织间隙作用于周围细胞，发挥其血管再生、抗凋亡、促进有丝分裂和免疫调节等生理作用。（4）归巢理论：BMSCs在多种因素的作用下可定向趋向性迁移越过血管内皮细胞至靶向组织并定值存活。[22]（5）信号通路：MSCS在特定环境下可分化为多种组织细胞，通过精确调控其信号通路，可诱导其向特定的细胞分化。MSCS在增殖及分化过程中存在Notch信号通路，在干细胞分化为心肌细胞的过程中Notch信号上调。7.实验结果评价指标的选择：（1）心肌酶学（2）心脏彩超（3）病理（4）通过微积分等方法计算坏死心肌面积（5）冠状动脉造影（6）核素心肌显像（7）免疫荧光标志物示踪法

8.讨论：

（1）移植时间、移植途径、移植细胞量的选择。（2）是否对骨髓间充质干细胞进行预处理。（3）移植后處理：如服用他汀类调脂药物可抑制骨髓间充质干细胞向成脂细胞分化。

参考文献：

[1]Mohammad Nurulqadr Jameel and Jianyi zhang.Stem Cell Therapy for Ischemic Heart Disease.Antioxid.Redox Signal.2010；13（12）：1879-97

[2]Friedenstein AJ，Petrakoua KU，Kurolesoua AI.Heterotopic trans plants of

bone marrow.Analysis of precursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues.J Transp Latation .1896；6（2）：230-247

[3]Antonitisis P，Kaidoglou A，Papakontantinou C.In vitro cardiomyogenic

Differfentitation of adult human bone marrow mesenchymal stem cells.The role of 5-azacytidine .Interact Cardiovasc Thorac Surg.2007 Oct；6（5）；593-7

[4]Wang J S，Shun D，Gapipeau J，et al.Marrow stromal cells for cellular cadiomyoplasty；feasibility and potential clinical advantages. J Thorac Cardiovasc Surg.2000 Nov；120（5）；999-1005

[5]丁志，杨松林.间充质干细胞生物学特性及其分化潜能[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15（1）：147-150

[6]蔡清明，周天玖.骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死的可能机制研究.中外医疗，2011.03

[7]周美玲，王爱玲，徐凤，陈锋.低氧增强骨髓间充质干细胞对缺氧诱导心肌细胞凋亡的可能性.中国组织工程研究与临床康复.2011.15（6）

[8]于勤，朱宁，李倩晓，李晓菲，那荣妹，郑晓群，方唯一.人血管内皮生长因子165基因联合间充质干细胞治疗对扩张型心肌病胶原重塑的影响.中国临床医学.2011，18（5）

[9]血管内皮生长因子基因转染骨髓间充质干细胞治疗缺血性心脏病的研究.中国学位论文全文数据库